Robert Anthony De Niro[3] lahir di daerah Greenwich Village, Manhattan, New York,[4] anak dari pasangan Virginia Admiral, pelukis dan penyair, dan Robert De Niro, Sr., seorang pelukis dan pematung ekspresionisme abstrak.[5] Ayahnya seorang keturunan setengah Italia dan setengah keturunan Ireland, sementara ibunya seorang keturunan setengah Jerman, dengan akar leluhurnya yang lain berasal dari Belanda, Inggris, Prancis, dan Ireland.[6][7][8] Datuk dan nenek buyut Italianya, Giovanni De Niro dan Angelina Mercurio, berasal dari Ferrazzano di provinsi Molise, Itali. Nenek dari pihak ayah, Helen O'Reilly, adalah cucu dari imigran Ireland.[9]

Kedua orang tuanya berkenalan, bertemu di kelas melukis Hans Hofmann di Provincetown, Massachusetts, namun mereka bercerai ketika beliau berusia tiga tahun setelah ayahnya melela kecenderungan diri menyukai kaum sejenis.[10] Beliau dibesarkan oleh ibunya di Greenwich Village dan Little Italy, Manhattan. Ayahnya tinggal dalam jarak yang cukup dekat dengan dirinya dan De Niro pun menghabiskan banyak waktu dengannya saat tumbuh dewasa.[11] Ibunya dibesarkan dalam ajaran Presbiterian tetapi menjadi seorang ateis saat dewasa, sementara ayahnya seorang Katolik murtad sejak usia 12 tahun.[10][12] Bertolak belakang dengan keinginan kedua orang tuanya, datuk neneknya secara diam-diam telah membaptisnya ke dalam Gereja Katolik ketika De Niro tinggal dengan mereka selama orang tuanya bercerai.[10][12]